微生物检验必须把握的三大耐药机制
你晓得哪些是微生物检验吗?你对微生物检验了解吗?下边是我为你们带来的关于微生物检验必需要晓得的三大耐药机制的知识，欢迎阅读。
一、产生灭活药物的各类酶
1、β—内丙酯酶(β-)
β—内丙酯类药物都共同具有一个核心β—内丙酯环，其基本作用机制是与真菌的抗生素结合蛋白结合，进而抑制真菌细胞壁的合成。形成β—内丙酯酶是真菌对β-内丙酯类抑菌抗生素形成耐药的主要诱因。真菌形成的β-内丙酯酶，可利用其分子中的谷氨酸活性位点，与β—内丙酯环结合并打开β—内丙酯环，造成抗生素失活。迄今为止报导的β—内丙酯酶已超过300种，1995年Bush等将其分为四型：第1型为不被克拉维酸抑制的阿莫西林菌素酶;第2型为能被克拉维酸抑制的β-内丙酯酶;第3型为不被所有β—内丙酯酶抑制剂抑制的金属β-内丙酯酶(需Zn2+活化)。可被乙二胺四羧酸和P-所抑制;第4型为不被克拉维酸抑制的抗生素酶。临床常见的β—内丙酯酶有超低毒β—内丙酯酶、头孢菌素酶(AmpC酶)和金属酶。
(1)超低毒β-内丙酯酶(-β-,ESBLs)
ESBLs是一类才能酯化抗生素类、头孢菌素类及单环类药物的β—内丙酯酶，属Bush分型中的2型β—内丙酯酶，其活性能被个别β—内丙酯酶抑制剂(棒酸、舒巴坦、他唑巴坦)所抑制。ESBLs主要由普通β-内丙酯酶基因(TEM—1，TEM—2和SHV—1等)突变而至，其耐药性多由引物介导。自1983年在美国首次发觉ESBLs以来，目前已报导的TEM类ESBIs已有90多种，SHV类ESBLs少于25种。TEM型和SHV型ESBLs主要发觉于麻疹克雷伯菌和大肠埃希菌，亦发觉于变型球菌属、普罗威登斯菌属和其他肠球菌科真菌。
国外近些年来随着三代阿莫西林菌素的广泛使用，产ESBLs菌的检出率逐年降低。NCCLs规定，凡临床分离的大肠埃希氏菌和克雷伯氏菌均应检测是否为产ESBLs弧菌;若形成，无论体外对第三代头抱菌素、氨曲南的药敏结果怎样，均应报告对三代阿莫西林菌素及氨曲南耐药。另外，ESBLs菌种除了对β-内丙酯类药物有很高的耐药率，并且对羟基香豆素类、喹喏酰基耐药率也在60%左右，因而，临床遇见由ESBLs造成的感染时，建议首选含β—内丙酯酶抑制剂的复方药物剂型或酸酐培南;对于阿莫西林吡肟等四代阿莫西林，尚有争议，按照抑菌药的PK/PD理论，适当改变给药剂量和给药间隔。以使血药含量超过真菌MIC的时间达40%给药间隔以上，其实是有效的。
(2)阿莫西林菌素酶(AmpC酶)届Bush分类中的1型(Ⅰ型)β—内丙酯酶。
一般将其分为由染色体介导形成的AmpCβ—内丙酯酶和由引物介导形成的AmpCβ—内丙酯酶，后者的形成菌有阴沟肠球菌、铜绿假单胞菌等，前者主要由麻疹克雷伯氏菌和大肠埃希氏菌形成。AmpC酶可作用于大多数抗生素，第一、二、三代阿莫西林菌素和单环类药物。而第四代阿莫西林菌素、碳青霉烯类不受该酶作用。该酶不能被β—内丙酯酶抑制剂所抑制。AmpCβ—内丙酯酶的形成有2种可能：①在诱导剂存在时暂时高水平形成，当诱导剂不存在时，酶产值急剧下滑，三代阿莫西林菌素、棒酸和碳青霉烯类药物是诱导型AmpC酶的强诱导剂;②染色体上控制酶抒发的基因发生突变，造成AmpC酶持续稳定高水平抒发。由高产AmpC酶耐药菌造成的感染死亡率很高。
实际上，所有的革兰氏阳性菌都能形成染色体介导的AmpC阿莫西林菌素酶，在多数情况下为低水平抒发;在肠球菌、柠檬酸链球菌、沙雷氏菌、铜绿假单胞菌中可高频诱导形成，且常为高产突变株。当临床出现上述病菌感染，开始几天三代阿莫西林菌素医治敏感，而此后发生耐药时，我们可怀疑为高产AmpC酶的真菌感染，四代阿莫西林菌素和碳青霉烯类药物不受具影响，可供临床选用。含酶抑制剂的复方剂型不能用于医治产AmpC酶弧菌的感染。
(3)金属酶(β-)
大部份β-内丙酯酶的活性位点是谷氨酸残基，但也有一小部份活性位点为金属离子的酶类。第一个发觉的以金属离子为活性中心的酶是由蜡样芽抱球菌形成的阿莫西林菌素酶，能被EDTA所抑制，然后世界各地均发觉了能形成这类酶的各类病菌。1988年Bush首次将该酶定名为金属β-内丙酯酶(β-)，简称金属酶。金属β-内丙酯酶耐受β—内丙酯酶抑制剂且可酯化几乎所有β—内丙酯类药物(包括吡啶培南)。该酶已在气单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德氏菌中发觉，其中嗜麦芽窄食单胞菌的吡啶培南耐药性由染色体介导，而脆弱拟链球菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌中引物介导的突变株在台湾已有报导。由粘质沙雷氏菌形成的金属β—内丙酯酶IMP-1型可在类似接合子的intl3上联通，早已传播到铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和产碱链球菌。金属酶可以酯化碳青霉烯类和近来开发的第四代阿莫西林菌素。金属β-内丙酯酶有广泛传播的潜力，对几乎所有的β—内丙酯类药物均具有酯化活性，是目前所知的最强的β-内丙酯酶-。
2、氨基糖苷修饰酶(或钝化酶/灭活酶)
在真菌对羟基香豆素类药物形成耐药的机制中，修饰酶介导的耐药最为流行，酶促修饰的羟基香豆素类药物不能与内质网体靶位作用，因而丧失抑菌活性。修饰酶主要包括甲基转移酶、磷酸转移酶和核苷转移酶。三类甲基香豆素修饰酶的作用机制各不相同：甲基转移酶(AAC)修饰依赖于酰基辅酶A的N-甲基化：乙酸转移酶(APH)修饰依赖于ATP的O-乙酸化;核酸转移酶(ANT)修饰依赖于ATP的腺苷化。在革兰氏阳性病原菌中，最常见的甲基香豆素修饰酶是AAC(6’)，使甲基香豆素类药物1—、3—、2’—或6'—位甲基化，现在已发觉16种编码AAC(6’)的基因。铜绿假单胞菌和肠球菌科真菌趋于于形成AAC(3)、AAC(6’)、ANT(2’’)以及APH(3’);蓝莓杆菌和粪肠杆菌常常形成ANT(4’)(4’’)或双功能的AAC(6’)/APH(2”)。猕猴桃杆菌对庆大霉素、卡那霉素和妥布霉素的`耐药性和肠杆菌的高度庆大霉素耐药性一般由双功能酶介导，这种酶一般(但非总是)由坐落多重耐药引物上的转座子(Tn924)编码，如蓝莓杆菌具有的转座子编码的APH(3’)(提供卡那霉素、新霉素和阿米卡星耐药性)，而其他的定位于染色体。越来越多的菌种可形成2种或更多种酶，对抗甲基香豆素类药物。在过去几年里常见的组合是庆大霉素修饰酶ANT(2’’)和AAC(3)]与AAC(6’)结合，造成对庆大霉素、妥布霉素、耐替米星、卡那霉素和阿米卡星的低毒耐药性。
甲基香豆素类药物对非发酵菌、肠球菌科及一些革兰氏阴性杆菌均有挺好的抑菌活性，与β—内丙酯类药物联用有协同抑菌作用，在感染医治中占有重要地位。但因为以上耐药机制的存在，真菌耐药问题也日趋严重，应当导致注重，可喜的是阿米卡星等对MRSA和产ESBLs菌种仍保持17%-40%的敏感率。
二、改变抗生素作用靶位
1、青霉素结合蛋白(PBP)的改变引起的β—内丙酯类药物耐药
抗生素结合蛋白(PBP)参与了肽聚糖合成的最后阶段。高分子量PBP经常为多模块，具有N末端糖基转移酶区和C末端转肽酶区。转肽酶区的活性位点谷氨酸与酶的天然结构相近，可与与β—内丙酯类药物发生不可逆酰化。链霉素结合蛋白(PBP)的改变常造成如下两种临床重要的耐药表型。
(1)耐甲氧西林金红色猕猴桃杆菌(-,MRSA)
MRSA是20世纪60年代美国首先报导的一种严重的临床耐药致病菌,20世纪80年代以来，世界各地都陆续发生MRSA诊所感染的暴发流行，并逐年增多。MRSA耐药分为固有耐药和获得性耐药，固有耐药是由染色体介导的，其耐药性的形成是由于真菌形成一种特殊的抗生素结合蛋白PBP2a(或PBP2’)，分子量为78000的蛋白质，与β内丙酯类药物的亲和力降低，进而造成真菌对β-内丙酯类药物耐药。PBP2a由mecA基因编码，95%以上的MRSA弧菌能测量到mecA基因，而敏感株则无。获得性耐药是由引物介导的，真菌获得耐药基因后，形成大量β-内丙酯酶(而不是PBPs)，使耐酶抗生素平缓失活，表现出耐药性，多为临界耐药。
在MRSA检查过程中，凡属MRSA，不管其对其他β-内丙酯类药物MIC值或抗菌圈的大小细胞膜透性，实验室均应向临床报告为对所有抗生素类、头孢菌素类、碳青霉烯类、碳阿莫西林烯类和β内丙酯类—酶抑制剂复合剂型耐药，以免欺骗临床服药。MRSA感染的医治是临床非常棘手的困局之一，关键是其对许多药物具有多重耐药性，万古霉素是目前临床上医治MRSA效果肯定的药物，应用30多年来未发觉耐药弧菌。
(2)耐抗生素脑炎杆菌(,PRSP)
常年以来麻疹球菌对抗生素高度敏感。MIC在0.005-0.01mg/L之间。1967年美国首次报导耐抗生素麻疹球菌,MIC为0.5mg/L，随后世界许多国家和地区均有报导，且耐药率迅速上升。PRSP的耐药机制百日咳杆菌的抗生素结合蛋白(PBP)发生改变，使其与抗生素的亲和力降低。百日咳杆菌有6种PBP：1a、1b、2x、2a、2b和3，其中PBP2b最为重要，假如链霉素结合到PBP2b上并使之抑制即造成真菌溶化和死亡;反之，PBP2b发生突变，抗生素不能形成作用，则造成PRSP。在PRSP高耐菌种中(MIC≥2μg/m1)可有多达4种PBP(主要是1a、1b、2x、2b)同时发生改变[7]。
百日咳杆菌是造成社区获得性气胸的重要致病菌。目前，国外PRSP的发生率在4%左右，显著高于亚洲国家细胞膜透性，在欧洲也属于中等水平，且MIC多大于1mg/L，为此，在社区获得性脑部感染病原菌中，PRSP尚不构成严重恐吓，抗生素仍可作为首选医治抗生素。并且耐药没有国界，中国近日PRSP发生率尚低.但决不意味着不要注重，而是应当进一步强化PRSP的耐药检测。对于PRSP感染临床诊治推荐使用阿莫西林噻肟/阿莫西林曲松、新喹诺酸酯(如司帕沙星)。若属PRSP严重感染则需应用万古霉素或加用甲硝唑。
2、DNA拓扑异构酶的改变导致喹诺酸酯药物耐药
喹诺酰基抗生素的作用机制主要是通过抑制DNA拓扑异构酶而抑制DNA的合成，进而发挥抗菌和灭菌作用。真菌DNA拓扑异构酶有I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，喹诺酰基抗生素的主要作用靶位是拓扑异构酶Ⅱ和拓扑异构酶Ⅳ。拓扑异构酶Ⅱ又称DNA促旋酶，参与DNA超螺旋的产生，拓扑异构酶Ⅳ则参与真菌子代染色质分配到子代真菌中。革兰氏阳性菌中DNA促旋酶是喹诺酰基的第一靶位，而革兰氏阴性菌中拓扑异构酶Ⅳ是第一靶位。
当编码组成DNA促旋酶的A亚单位和B亚单位及组成拓扑异构酶Ⅳ的parC和parE亚单位中任一亚基的基因发生突变均可导致喹诺硫醇的耐药性。在所有的突变型中，以gyrA的突变为主，占80%左右，其次是gyrB、parC和parE突变。在所有那些突变类型中，若Ⅱ型拓扑异构酶上存在2个突变点(如gyrA和parC上)，它们造成对氟喹诺硫醇的耐药远远小于只有一个突变点(如gyrA或gyrB上)，后者是前者的3-4倍。同时没有发觉突变仅出现在parC基因这一现象。这可能是由于DNA促旋酶是氟喹诺硫醇的重要靶位,gyrA亚单位的改变可导致酶结构发生变化致空间位障，制止喹诺硫醇步入喹诺酸酯作用区，或造成化学物理变化，干扰喹诺酮与酶的互相作用。这种结果显示gyrA上突变的出现是导致真菌对喹诺酰氯发生耐药的主要机制，而parC突变只是进一步导致铜绿假单胞菌对喹诺酮的高度耐药。
DNA拓扑异构酶的改变是真菌耐喹诺硫醇抑菌药的主要机制，其他耐喹诺硫醇的机制还包括前面即将提到的真菌膜私密性改变和主动外排机制。
三、细胞膜透性屏障和药物主动外排泵
真菌可以通过细胞壁的障碍或细胞膜私密性的改变，产生一道有效屏障，致使药物未能步入细胞内并达到作用靶位而发挥抑菌效能，这也是真菌在进化与饲养过程中产生的一种防卫机制。这类耐药机制是非特异性的，主要见于革兰氏阳性菌。由于革兰氏阳性菌细胞壁粘肽层外边存在着类脂单层组成的外膜，内层为脂寡糖，由紧密排列的碳氮分子组成，妨碍了疏水性抑菌药步入菌体内。另外真菌外膜上还存在着多种孔蛋白，分子较大者为OmpF，分子较小者为OmpC，它们可产生特异性通道(OprD)和非特异性的通道(OprF)，作为营养物质和亲水性抑菌抗生素的通道。抑菌抗生素分子越大，所带负电荷越多，疏水性越强，则不易通过真菌外膜。真菌发生突变丧失某种特异孔蛋白后即可引起真菌耐药性,另外因为外膜蛋白OprF的缺位，使抗生素不易通过而形成耐药性。如铜绿假单胞菌特异性孔蛋白OprD2缺位即造成碳青霉烯类药物耐药。
另外一种造成真菌非特异性耐药的机制是真菌主动外排泵的存在，可以将步入真菌体内的抗生素泵出膜外，因而逃避药物的作用。主动外排系统因为能特异地将步入细胞内的多种抑菌抗生素主动泵出细胞外，造成细胞获得耐药性。如大肠埃希氏菌中的多药外排泵-TolC系统可以造成真菌对包括氯霉素、氯霉素、红霉素、β—内丙酯类、利福平、氟喹诺硫醇、氧化剂、有机溶剂、碱性颜料等多种结构不相关的抗生素耐药。铜绿假单胞菌的MexAB-OprM系统的主动外排作用也是造成铜绿假单胞菌固有的多重耐药性的重要诱因之一。
真菌的膜耐药机制主要表现在铜绿假单胞菌的多药耐药性。铜绿假单胞菌几乎涵盖了包括膜耐药在内的所有真菌耐药机制，其耐药已成为当前感染医治中较为棘手的问题之一，尤其值得注重和研究。
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