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利用荧光显微镜测定膜电位的方法和标准曲线曲线制作

更新时间:2023-11-22 文章作者:佚名 信息来源:网络整理 阅读次数:

细胞电位在细胞通信中有着重要的作用,本人整理了下借助萤光显微镜测定膜电位的方式、用酶标仪测定膜电位的方式以及膜电位的标准曲线制做。6en物理好资源网(原物理ok网)

膜电位测定6en物理好资源网(原物理ok网)

I.用萤光显微镜测定膜电位的方式6en物理好资源网(原物理ok网)

1.试剂6en物理好资源网(原物理ok网)

·(3)6en物理好资源网(原物理ok网)

·’sMEM(DMEM)6en物理好资源网(原物理ok网)

·FBS(fetalserum)6en物理好资源网(原物理ok网)

2.方式6en物理好资源网(原物理ok网)

1)将消化好的细胞移至DMEM中。6en物理好资源网(原物理ok网)

2)加入FBS,控制含量范围在:2-15%。6en物理好资源网(原物理ok网)

3)加入(3),控制含量范围在:1-5μmol/l。6en物理好资源网(原物理ok网)

4)用萤光显微镜观察剌激后萤光硬度的变化。[Ar激光(488nm)的激光共聚焦显微镜],因为(3)的萤光会随气温变化而改变细胞膜电位,所以必须在37℃的条件下测定。因为细胞膜的电位会变化,可以观察细胞质内的萤光硬度变化。6en物理好资源网(原物理ok网)

II.用酶标仪测定膜电位的方式6en物理好资源网(原物理ok网)

1.试剂6en物理好资源网(原物理ok网)

·(3)6en物理好资源网(原物理ok网)

测量用缓冲液(pH7.4;20mmol/lHEPES,120mmol/lNaCl,2mmol/lKCl,2mmol/lCaCl2,1mmol/lMgCl2,6en物理好资源网(原物理ok网)

5mmol/l)6en物理好资源网(原物理ok网)

2.方式6en物理好资源网(原物理ok网)

1)培养细胞:在多孔板中培养细胞6en物理好资源网(原物理ok网)

2)清洗细胞:用含5μmol/l(3)的检查用缓冲液200μl,清洗多孔板中培养的细胞2次6en物理好资源网(原物理ok网)

3)染色:在孔板中加入180μl含5μmol/l(3)的检查用缓冲液,在5%CO2,37℃培养箱中孵育306en物理好资源网(原物理ok网)

分钟。6en物理好资源网(原物理ok网)

4)测定:用萤光酶标仪观察剌激后萤光硬度的变化。因为(3)的萤光会随气温变化而改变,所以必6en物理好资源网(原物理ok网)

须在37℃的条件下测定,加入20μl含(3)的检查用缓冲液,每隔30秒测定1次萤光变化。6en物理好资源网(原物理ok网)

III.膜电位的标准曲线6en物理好资源网(原物理ok网)

1.原理6en物理好资源网(原物理ok网)

膜电位变化时色素的分布也急剧变化,所以萤光和吸收也会变化。这些变化程度取决于色素的分子数和细胞数的百分比、色素的含量以及细胞的种类。膜电位的标准曲线是通过用电极直接测定目的细胞的膜电位,在该电位所测得的萤光和吸收硬度而制得的。6en物理好资源网(原物理ok网)

2.试剂6en物理好资源网(原物理ok网)

·(3)6en物理好资源网(原物理ok网)

·Eagle-6en物理好资源网(原物理ok网)

·PBS6en物理好资源网(原物理ok网)

3.方式6en物理好资源网(原物理ok网)

1)用Eagle-培养细胞。6en物理好资源网(原物理ok网)

2)取PBS中的细胞在37℃的CO2培养箱中孵育30-60分钟,之后改变孵育时间,制备不一样的CO2含量的样品。6en物理好资源网(原物理ok网)

3)加入(3),终含量为2μmol/l。6en物理好资源网(原物理ok网)

4)20分钟后,在517nm测定各个含量的萤光硬度,并用电极直接测定此时的电位差。6en物理好资源网(原物理ok网)

5)用萤光硬度和对应的电位差来制做标准曲线。6en物理好资源网(原物理ok网)

4.其他方式6en物理好资源网(原物理ok网)

有钾扩散电位和萤光或吸收硬度比较的方式。缬氨霉素导致钾扩散电位,钾扩散电位(V)是根据等式估算如下:6en物理好资源网(原物理ok网)

V=-RT/Flog[K+]in/[K+]out=-59log[K+]in/[K+]out(mV)6en物理好资源网(原物理ok网)

所以在缬氨霉素存在时,通过改变细胞外钾离子含量和细胞内钾离子含量,估算扩散电位,测定各个电位的萤光或吸收硬度细胞膜电位,比较后可以得到标准曲线。6en物理好资源网(原物理ok网)

细胞膜电位和细胞自噬有着密不可分的关系,假如细胞膜电位崩?;够岢鱿窒赴允伞D壳把芯孔疃嗟氖窍吡L搴拖赴允傻墓叵担芯肯吡L迥さ缥豢梢越柚┕庀晕⒕?,也可以借助流式细胞仪。6en物理好资源网(原物理ok网)

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